本发明提供了对原始解链数据和解链曲线进行操作,以产生检测数据的校准并进一步改进数据分析。所述数据获自多区平台的各个支持区,例如获自多孔板的每个孔。在用该样品进行试验之前,各支持区能够装载多份相同的样品。在一些实施方式中,本发明提供了产生可显示出样品解链特性的解链曲线解链过渡区方法。在一些实施方式中,对解链曲线数据依据染料温度进行校正,以进一步改进分析。在一些实施方式中,从解链数据获得特征向量,并且将特征向量用于进一步改进解链曲线的基因分型分析。
1.用于非诊断用途的分析解链曲线数据的方法,该方法包括:对于置于样品载体中的复数个支持区的相同校准样品,生成一组解链曲线数据,其中该解链曲线数据为解链曲线数据校准组;对于置于样品载体中的复数个支持区的至少一个试验样品,生成一组解链曲线数据,其中该解链曲线数据为解链曲线数据试验组;对于分析系统噪音,用解链曲线数据校准组,来对解链曲线数据试验组进行校正;在估算温度范围内,对校正的解链曲线数据试验组,成比例缩放;对解链曲线数据解链区的低温区,将成比例缩放的解链曲线数据试验组拟合至估算出的渐近线;以及基于校正、成比例缩放和拟合步骤,将解链曲线数据试验组进行分类。
2.权利要求1的方法,其中该方法进一步包括从拟合后的解链曲线数据试验组生成微分数据,其中将复数个样品中的试验样品的解链曲线数据选作参照,而将校准样品的解链曲线数据从参照中减去。
3.权利要求2的方法,其中从微分数据生成特征向量。
4.权利要求3的方法,其中基于校正、成比例缩放、拟合和生成微分数据的步骤,将解链曲线数据试验组进行分类。
5.权利要求1的方法,其中基于解链曲线数据的导数形式进行校正。发明领域本发明的领域涉及分析解链曲线数据的方法,特别是涉及复数个样品解链温度很小变化的数据的分析方法。发明背景DNA扩增方法提供了用于基因组分析的一种强大而广泛使用的工具。聚合酶链式反应(PCR)方法,例如,可允许定量分析确定DNA拷贝数量、样品来源定量、以及基因表达转录分析。解链曲线分析是一种重要工具,其可用于分辨人造产品的实时扩增产物而用于基因分型和突变检测。DNA分析方法可允许检测基因组特定区的单碱基变化,例如单核苷酸多态性(SNPs)。SNP分析和其他技术,可用于鉴定与特定疾病和症状,例如各种癌症、地中海贫血症等等相关的突变。解链曲线数据的统计分析偏差,是因为分析系统存在系统噪音,例如热循环仪的热循环模块存在热不均一性。对于某些基因分型应用而言,样品之间的解链温度变化可能只有很小。在SNP分析的情况中,SNP突变改变解链温度不超过0.2°C。因此,本领域需要在分析的固有噪音存在情况下,分析解链曲线微小差异的方法。附图简述图1为一流程图,其记载了用于分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式。图2为一流程图,其记载了用于分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式。图3记载了一系列。图4记载了一组校准数据的系列解离解链曲线。图5记载了按照分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式,将图3采取估算温度范围的系列图。图6A和图6B图示了,按照分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式,对于例如图5所示的图像的低温区,进行渐近线估算。图7记载了,按照分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式,如图6A和图6B所示,而重作的图5的系列图。图8记载了,按照分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式,作出的一组试验数据的系列解离解链曲线。图9记载了,按照分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式,作出的具有分析系统偏差或噪音校正的图8系列图。图10为,按照分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式,分析出的一组试验数据。图11为,按照分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式,分析出的一组试验数据。图12为,图11试验数据的绘图样式。发明详述本文公开了分析解离解链曲线数据方法,或者当在本文中使用时,分析解链曲线数据(MCD)方法的各种实施方式,其中各样品之间的解链温度差异较小。例如,用于分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式,选定解链温度差异仅有非常小变化的样品组。按照分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式,将一标准组解链曲线数据作为校正试验组解链曲线数据的基础,例如,涉及到分析系统偏差或噪音。根据各种实施方式,可以用曲线拟合技术处理解链曲线数据。在分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式中,解离解链曲线数据的不同属性,例如利用不同图表产生的那些属性,可以用作试验解链曲线数据簇聚分析的基础。DNA解链曲线分析的一个已知方法是,利用插入双链DNA的特异性染料,例如SYBRxa0Green进行荧光监测。当双链DNA扩增产物形成时,SYBRxa0Green染料附着于DNA,而且只要DNA保持为双链,其持续与DNA结合。当达到解链温度时,双链DNA显示出变性或解链,并且因为SYBRxa0Green从解链链中分离,观察到荧光显著降低。可检测的染色荧光强度,在解链过程中典型地将会降低大约1000倍。当样品加热直至达到解链温度时,将荧光作为温度的函数绘制曲线,可产生DNA解链曲线。DNA解链曲线的形状和位置,可反映出DNA的序列、长度、和GC/AT含量。而且,确认PCR反应真实性的各种方法,都依赖于解链曲线分析以区分人工产物与真实扩增产物。解链曲线分析也可以用于区分各种多重DNA扩增的产物,而用于延长定量PCR的动力学范围。DNA解链曲线分析也可以用作优化PCR热循环条件的强有力工具,因为DNA片段或其他材料的解链分离点可以被更加精确地确定。在一些实施方式中,解链曲线分析方法计算显示为多组分染色强度数据对温度的一阶导数,即微分解链曲线。微分解链曲线峰点的解链温度T_m,可以用于鉴定生化反应的产物。多重扩增产物的样品,将会显示出微分解链曲线的复数个峰。在一些实施方式中,解链曲线检测包括极为精确的温度测量,而允许利用解链温度T_m来鉴定样品。关于利用微分解离解链曲线检测方法的各种实施方式对T_m进行确定,公开于美国专利申请12/020,369,该申请整体并入本文作为参考。如图3A和图3B所示的各种实施方式,将样品装载至样品载体中。在各种实施方式中,如图3A所示,样品载体10包括基底11,所述基底11分别设置有基本平整的上表面和下表面13,15。样品载体的各种实施方式,可以在表面13上设置有复数个样品区14。在各种实施方式中,基底11可以是具有复数个样品区14的玻璃片或塑料片,其可以通过盖子12与外界环境隔离。样品载体的一些实例包括但不限于,如图3B样品支持装置20所描述的多孔板,例如标准微滴96孔、384孔板或微缩片,所述装置具有复数个样品区或孔24,其可以通过盖子22与外界环境隔离。样品载体的各种实施方式的样品区可以包括凹陷状、锯齿状、山脊状、或其组合,以规则或不规则形式排列于基底表面。在图3A和图3B中,显示样品载体放置于热循环系统。在热循环系统的各种实施方式中,具有热组件60和检测系统51。检测系统51具有发射电磁能量56的发光源52,以及从图3A和图3B各所示的样品载体10和20的样品中,接收电磁能量57的检测器54。在各种实施方式中,将重复的等份样品装载至板中,以确定每孔的解链温度T_m。理想地,如果样品是重复性的,每孔的Tm温度应该相同。在实践中,分析系统的偏差,例如分析系统加热元件的不均一性,可导致重复样品组的偏差。在分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式中,使用重复样品的该解链曲线数据可以用作校准数据组。在图1的步骤10中,这样的复数个解链温度可以包括复数个或一组标准解链曲线数据(CMCD)。类似地,如图1的步骤20所示,在分离样品板中,感兴趣待分析的未知样品,可以被分散至样品载体的复数个支持区,以确定未知样品的解链温度。这样的复数个解链温度,包括复数个或一组试验解链曲线数据(EMCD)。在分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式中,如图1步骤30所示,在后续步骤例如比例缩放、曲线拟合、以及分类分析之前,可将信号处理步骤用于原始解离解链曲线数据。这样的信号处理步骤包括对具有分析系统偏差或噪音的EMCD的校正。分析系统的噪源例如包括但不限于,热不均一性、励磁源不均一性、以及检测源的噪音。在图1步骤40所示的各种实施方式中,通过在估算温度范围内比例缩放数据,可以处理解链曲线数据,以除去界定解离解链曲线真实差异的不相关信息,其中所述解离解链曲线具有仅非常小差异的解链温度。例如,在图4中通过使用一组CMCD,可以解释图1步骤40的各种实施方式。图4所示的CMCD代表了96份的重复样品,其中信号强度为温度的函数。在50°C-55°C之间的曲线低温区,人工产物与解链曲线数据不相关、存在线性偏离。而且,如图4所示,显然解链发生在约70°C-约90°C区域之间,而且在解链温度以上强度达到零。此外,显然在约55°C-约80°C的区域,其强度为单向降低。这是因为,基于染料发光的温度依赖,重复样品的发射光减少,这已知为成反向关系(即当温度增加,染料发光减少)。在分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式中,如图1步骤40所示,基于下列观测进行校准数据的曲线拟合:约50°C-约55°C之间的区域包含人工产物,约55°C-约80°C之间的区域应该为线性,约70°C-约90°C发生解链,以及解链温度以上的高温区为零。在各种实施方式中,校准数据的曲线拟合,可以进一步使用标准组的参考孔信息。例如,在解链曲线分析进行前,可以标准组中初始最亮的孔,选择作为参考孔。在分析完成之后,对标准孔的解链曲线数据,求一阶导数。标准孔一阶导数的峰宽,与解链发生在约70°C-约90°C区的观测图相结合,可用于确定横坐标。进一步地,假定已知55°C-约80°C区应该是线性的,那么,纵坐标可以使用相对值成比例缩放,其中纵坐标的最大值可以纵坐标解链曲线数据的低温截取部分来设置,而且解链曲线图谱的高温部分应该达到零。在图1步骤40的各种实施方式中,为了说明的目的,图4的CMCD已被成比例缩放,以产生图5所示的解链曲线数据。对于图5,图4的校准数据已被拟合为横坐标对应于约70°C-约88°C之间。此外,CMCD低解链端的线性部分,通过截取低温端值已拟合为100,而解链曲线图谱的高温部分达到零。在分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式中,除了图1步骤40的曲线拟合之外,还可以将其他的曲线拟合步骤用于校准数据。例如,如图1步骤50所示,在各种实施方式中,为了检测出解链曲线数据组之间的差异,通常期望估算出曲线低温端的渐近线,其中所述解链曲线数据组具有仅非常小变化的解链温度。估算解链曲线数据的低温端渐近线的各种实施方式,如图6A和6B所示。在图6A中,通过选择低温解链范围一个狭窄区域的线性部分,直线B通过解链曲线A外推而得到。在各种实施方式中,可以在确定温度点的温度变化的某个区间段,来选择线性部分。在各种实施方式中,可以用一阶导数来选择确定的温度点,并确定过渡区,例如但不限于,通过使用一阶导数最大峰值半峰处的峰全宽。本领域的普通技术人员知道,这样的过渡区相当于一阶导数中值的两个标准偏差的区间。这样,曲线的其他区间也可以选出。在各种实施方式中,当低温区已知为线性时,可以在确定的过渡区的低温端,选择温度点。在各种实施方式中,当温度点被选择以后,就可以选出包含足够数据点的点区间,以外推出线。在此方面,区间将会对应于至少两个数据点。在各种实施方式中,区间可以至少为约0.1°C。在各种实施方式中,区间可以至少为约0.5°C。在其他实施方式中,区间可以至少为约1°C。例如,可以选择约70°C的温度点,在温度点附近具有±0.5°C的间隔。从该狭窄的线性区,可以外推出如图6A直线B所示的直线。通过运算,例如将解链曲线A与直线B相减,可以计算出预设极限的两函数偏差点。例如但不限于,当两曲线之间的差异至少是分析噪音的例如两倍时,那么,该计算出的差异可认为是显著差异。可选地,在各种实施方式中,可以使用其他方法确定预设极限的两函数偏差点,例如用于测定类似系统分析的非线性的方法。该预设极限显示为图6A的C点。点C是指一个点,通过该点,水平穿过纵坐标画出直线D,由此确定出低温区的估算渐近线。如图6B所示,根据该渐近线——直线D,拟合出标准解链曲线A。在图7中,图5的校准数据已经被拟合为估算的低温渐近线。可将图1的步骤40和步骤50,应用于测试样品所产生的试验数据组。图8表示的数据代表了一组试验数据,其已经根据图1步骤40和步骤50所记载方法的各种实施方式进行了拟合。将图8的EMCD,按照基因分型进行簇集。如图8的EMCD所示,基因分型的解链曲线数据,出现了显著重叠。如上所述,如图1步骤30所记载,在各种实施方式中,可以在步骤例如图1的步骤40和50之前,将信号处理步骤应用于原始解离解链曲线数据。这样的信号处理步骤可以包括对具有分析系统偏差或噪音的EMCD的校正,例如包括但不限于热循环系统中固有的分析系统的热不均一性。如上所述,标准解链曲线数据组产生自重复性的相同样品,因此校准数据偏差归因于分析系统的固有噪音,其中所述的样品分散在样品载体的支持区中。因此就系统噪音而言,标准解链曲线数据的信息,可以用于校正试验的解链曲线数据。例如,可以选择EMCD的参考样品区。在各种实施方式中,可以确定样品载体中的样品区,例如孔的强度的频率曲线,然后将在EMCD峰强度两个标准偏差之内的样品区,选择作为参考样品区。在各种实施方式中,可以选择相应于最大强度的为EMCD的参考样品区,然而为了选择一个参考样品区例如孔,两个标准偏差以内的任何样品区都不应是离群区;即它们过暗或过亮。在图1步骤20所示的校正系统噪音的各种实施方式中,CMCD的相应样品区也可以选择作为CMCD的参考样品区,例如孔。在各种实施方式中,CMDC参考样品区与样品支持物上的任意样品区之间的差异,可以计算为解链曲线数据的任意分数,或者解链曲线数据的任意形式,例如但不限于导数。对样品载体上样品支持区的、因分析系统噪音产生的偏差校正,也可用于EMCD。也可使用其他方法,来确定校正因子。例如,可以将平均强度的CMCD,作为整个CMCD样品组。对于任何特异性的CMCD样品区,通过将样品区强度从平均强度减去来进行校正。该校正也可以用于EMCD的相应样品区。将如上所述对图1步骤20的校正用于图8,结果显示在图9中。显然,图9所示的校正试验数据,可致基因分型灵敏分类。表格形式显示的一组EMCD,示于图10中。在图10中,第一列显示了以前确认的样品基因型。第二列代表的一组是基于没有利用校准数据对分析系统噪音进行校正的试验数据。最后,第三列代表的一组是基于利用校准数据对分析系统噪音进行了校正的试验数据。如标题所示,没有利用校正试验数据的一组的正确率为40%,而利用校正试验数据的一组的正确率为90%。而且,标记为′′ntc′′的样品为非模板对照,其是预期没有解链曲线的阴性对照。校正MCD总是指阴性对照校正。因此,图1所示的分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式,其在确定基因分型中是有效的,其中该试验数据组的解链温度仅只存在非常小差异。在分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式中,可进一步分析试验解链曲线数据,以检测出仅只存在非常小差异的数据之间的真正差别。根据各种实施方式,在图2的步骤150中,利用试验数据生成微分数据。一组试验数据的微分数据图显示于图12,其相应的样品显示于图11表格。在图12中,将野生型样品的解链曲线数据,作为与所有其他样品的所有其他解链曲线数据相比较的数据。解链曲线数据之间、以及与野生型之间存在差异,其显示在图12中。横坐标的数值范围设置,如前所述。纵坐标值为基于参照解链曲线数据定义为零的相对值,其中根据该定义,最小值和最大值设置为微分数据的最大偏移值。感兴趣的数据相应于,坐标正数区的峰特征。根据图11表格所列的相应样品,对图12的微分图进行了标记。在图11的表格中,解链温度T_m,显示在对应样品数据的第1列。第2列称为Deltaxa0Max,进入该列的值为坐标正数区峰,野生型与样品峰之间的相对差异值。第3列,T_Deltaxa0Max为Deltaxa0Max处的相应温度。最后一列,绝对微分之和(SAD)为样品峰下的面积。因此,图2步骤150的各种实施方式显示于图11和图12中,其中如图12所示,生成的微分数据成为了除了解链温度之外的,例如Deltaxa0Max,TpeitaMax,和SAD,这些特征向量的生成基础。根据图2步骤160所示的分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式,特征向量可用于进一步区分数据组的差异,其中它们的解链温度仅只存在非常小的差异。例如,在图11的表格中,这些样品已知是不归为一类的样品。也就是,与图9代表的复数个样品或样品分类的数据不同,在基因分型时,对于图11代表的数据而言,这些样品应该是可区分的。利用这些特征向量可以提供更多的信息,其中仅只存在非常小差异的解链温度的样品,可被进一步区分。通过查看图11的表格数据,很明显,样品2具有T_m为84.1°C,其与具有相同T_m为84.2°C的样品3和4之间的差异,仅为0.1°C。然而,三个样品之间的Deltaxa0Max的差异显著,可以清楚地予以区分。因此,使用其他的特征向量,可用于进一步区分样品。同样地,阴影所示的数据区域,样品5-10,它们都具有解链温度84.5°C。虽然大多数样品可以用Deltaxa0Max进一步区分,然而样品8和样品9只能用SAD特征向量予以区分。根据图2步骤160的分析解离解链曲线数据方法的各种实施方式,特征向量的某些或任意组合,可以用于进一步评估EMCD。在图2步骤160的各种实施方式中,可以将EMCD依次按照特征向量分类,而且拟合评估也可在每次叠代之后进行。在图2步骤160的各种实施方式中,可以将EMCD按照一个特征向量,或者按照特征向量的任意组合作为叠代处理,进行分类,而且数据的评估可以是拟合评估,可以在每次叠代之后进行。在本发明的原理已经记载在分析解离解链曲线数据方法实施方式中的情形下,应该明确理解,这些记载仅仅以实施例的方式作出,其并不意味着本发明的范围。提供本文公开的内容,作为解释和说明目的。它并不意味着穷尽或限制公开的内容,于具体的记载形式。多种修饰和变化,对本领域的技术人员来说将是明显的。选择和记载公开的内容,是为了更好地解释所记载技术其公开实施方式的原理和实际应用,由此能使本领域的其他技术人员,能够理解可以构思出,适合特定用途的各种实施方式和各种修饰。期望本文公开的范围,以下列权利要求及其等同形式所定义。